植物初級生產力約占全球碳固定的一半。目前初級生產力的測量方法主要為兩種：
衛星遙感：
在盡可能廣泛的空間和時間尺度上運作
測量的PhytoPP誤差較大
14C示蹤法
最廣泛使用的直接評價PhytoPP方法
操作的空間和時間尺度有限，導致極端欠采樣
Chelsea Technologies的LabSTAF系統是在NERC資助的OCEANIDS計劃（NE/P020844/1）中開發的。開發下一代更小、更節能、可部署的STAF系統在歐盟資助的海洋傳感技術（TechOceanS）方案內仍在繼續進行。我們目標是發展以STAF為基礎的工具和方法來評估PhytoPP，與使用14C示蹤劑方法相比，可以在更寬的空間和時間尺度上實現PhytoPP，并具有相當的準確度和精密度。
本文的目的是概述STAF熒光儀系統作為在空間和時間尺度上測量PhytoPP的平臺，大大緩解了現有的采樣不足問題。
目標平臺包括：
科考船上的實驗室及航行系統（LabSTAF）
大型自動駕駛平臺，包括AutoSub LR和AutoNaut（AutoSTAF）
小型自主平臺、滑翔機及Argo浮標（下一代STAF測量系統）
對于PhytoPP評估：
所有STAF系統的高動態范圍（從極端寡營養到中營養）
高度自動化，基于STAF的PSII光化學通量（mol electrons m -3-3 s-1）測量
通過14C固定驗證的STAF方法（mol C m-3-3 s-1）
總體目標：
盡量減少使用STAF生成 PSII光化學通量值時產生的誤差
增加我們對決定因素Φe,C 的理解
STAF基礎測量
圖1 所有的STAF儀器都采用了單周轉（ST）方法，通常使用100 μs的LED 脈沖來使PSII光合作用達到飽和。被測量的樣品體積小于總量的5%（10~20 ml）。被動式樣品交換允許高測量頻率，并在極端寡營養條件下提供高質量的數據。
在圖1中，F v 是 “可變”熒光。Fo 和Fm分別是可變熒光的“初始 ”和“最大”熒光水平。σPII是PSII光化學的吸收橫截面。在光照照射下，分別相當于Fq'、F'、Fm'和σPII'。盡管沒有單位，但所有由STAF系統報告的熒光（F）值都是在校準的基礎上。報告的σPII值單位為nm -2 PSII-1。
FLC生成rP-E曲線
熒光光曲線（FLC）包括在黑暗和飽和光之間的幾個光合輻照度水平上進行的一組自動STAF測量。FLC生成的數據集可與基于14C示蹤劑的光合作用光子輻照度（P-E）曲線相媲美。
圖2 第一步數據處理生成相對光合作用光子輻照度（rP-E）曲線，其中rP值為入射光子輻照度與PSII光化學效率（ΦPII'）的乘積。無量綱ΦPII'的值由Fq'/Fmc'算出。這里的報告rP單位為μmol photons m-2 s-1，表示PSII光化學通過1 m2σPII'的速率。
Fmc'中的“c”下標表示已應用基線校正（參見校正要求）。
一系列其他的STAF衍生的參數是由RunSTAF在FLC層面產生。在這個例子中，Fm'和τt'是由rP繪制。Fm'的下降通常伴隨了PSII光化學的下調情況。τt' 時間常數跟蹤PSII光化學的周轉時間，報告單位為μs。
每PSII或每單位體積光化學通量
假設每個PSII光化學事件導致一個電子從氧轉移到質體醌，rP的SI單位為mol electrons m-2 s-1。STAF系統允許將rP值轉換為PSII光化學通量。每PSII光化學通量的SI單位為electrons PSII-1s-1，定義為JPII。每單位體積（海洋或其他介質）的光化學反應的SI單位為mol electrons m-3 s-1，定義為JVPII。RunSTAF采用Sigma方法生成JPII的報告值（公式1），采用吸收法生成JVPII報告值（公式2）。
Sigma方法和吸收法
圖3 Sigma方法可以從STAF數據中提供JPII（electrons PSII-1 s-1），不提供JVPII（mol electrons m-3 s-1）。將Sigma衍生的JPII轉換為JVPII需要獨立評估光化學活性濃度PSII m-3（圖中以紅色顯示）。雖然吸收方法可以直接從STAF數據中提供PSII m-3，但將該值代入Sigma方程使其與吸收方程完全等價（包含的σPII值抵消了）。
校正要求
生成JPII和JVPII值需要光譜校正。生成JVPII還需要對包裝效應進行校正（圖5），并對基線熒光進行評估（圖6）。譜校正需要精確測定用于提供ST測量脈沖和光化光LED的光子通量和光譜輸出，以及樣品的光化學激發曲線(PEP)，打包效應校正是通過雙波段測量最大和最小重吸收的熒光發射（10 nm半帶寬，集中在685 nm和730 nm）來實現的。基線熒光校正適用于光失活PSII復合體積累導致的Fv/Fm測量值較低的情況。
使用PEP進行光譜校正
PEP的主要作用是便于對JPII和JVPII進行光譜校正。PEP數據是使用LED測量波段的不同組合產生的。RunSTAF由這些不同組合的ST曲線計算Fv和σPII值。Fv用于光譜校正。雖然生成PEP在技術上具有挑戰性，但該過程是完全自動化的，通常不需要超過兩分鐘的測量。
圖4 一個PEP曲線包括了416~622 nm的光譜。光譜校正光譜（SCS）的范圍將Fv PEP擴展到380~660 nm之間。上部圖中的紅線顯示了天然淡水樣本的擴展PEP。LabSTAF內的光化LED的發射光譜顯示為藍色。圖中還包括了七個LED測量波段的發射光譜。上部圖中黃色虛線顯示的是來自光化光源的一個發射光譜。添加此功能是為了方便比較STAF與14C固化平行測量的數據。在下部圖中，來自光化光源的光譜已應用于LabSTAF數據集（應用ESD）。這將觸發所有受影響參數值的重新計算，包括αLHII和Ek。αLHII的變化與JVPII是呈正比的（見公式2）。
打包效應修正
圖5 使用STAF測量，熒光發射通常在685 nm測量。這為光化學活性PSII配合物和其它源的發射提供了最大的光譜區分。缺點是PSII對熒光發射的重吸收在該波段內接近最大值。在這個波段內，實際的重吸收水平取決于單個細胞的光學特性（封裝效應）。在685 nm和730 nm測量的Fv的比率可以用來校正封裝效應。通常，完全自動化的包裝效果校正需要不超過30秒。
基線校正
圖6 在此例中，ST脈沖應用于暗適應樣品產生的Fv /Fm為0.382，這明顯低于從“健康”暗適應細胞中廣泛看到的0.5至0.65范圍。這個較低的值可能是PSII光化學被抑制的結果，或者可能表明除了光化學活性的PSII復合體（包括光失活的PSII復合體）以外的其他來源的高水平熒光與在健康范圍內的內在PSII光化學效率相結合。公式3可用于計算在假定的本征Fv /Fm（公式中的Fv /Fmc項）上的基線熒光（Fb）。
JVPII與14C固定的直接比較
需要對JVPII和14C固定進行平行測量，以了解控制它們之間可變比例的因素。迄今為止，方法上的不一致，包括孵育長度和光質量的差異，極大地抑制了電子碳比的實際評估（Φe,C值）。圖7中的圖像顯示了LabSTAF單元用于運行JVPII和14C固定的“雙重孵育”測量。LabSTAF內置的相對較大的樣品室（25mm內徑和56mm高度）便于進行此測量。14C加標樣品包含在閃爍瓶（23毫米外徑）。除了為兩個測量提供單一的光化光源外，這種安排還允許在整個14C 的孵育期內進行STAF測量。
圖7 LabSTAF內的大樣品室允許使用閃爍小瓶，以方便使用單個光化光源（雙孵化）平行測量JVPII和14C固定。左邊的圖是在北大西洋用天然浮游植物組合進行的一組雙重孵化。 在這個示例中，Φe,C的范圍從大約5到略高于7。這個范圍比在以前的實驗中觀察到的要小得多，在以前的實驗中，STAF評估率和14C評估率是并行測量的，而不是同時測量的。JVPII值包括RunSTAF軟件中用于運行系統和處理數據的自動光譜和打包效應校正。
光化學激發光譜（PEP）
如上所述，PEP的應用是為了促進JPII和JVPII的光譜校正。RunSTAF計算Fv和σPII的波段特定值。雖然Fv PEP值在很大程度上不受樣品內光譜異質性的影響，但σPII PEP值則不是。因此只有Fv PEP值用于校正JPII和JVPII。
圖8 PEP是通過平均用戶設置的ST曲線數的每個組合波段來構建的。LabSTAF或AutoSTAF單元循環Steps列表，直到獲得所需數量的曲線為止。使用LED的最佳組合可確保在ST脈沖期間關閉足夠高比例的功能PSII復合體，以產生準確的Fv和σPII。
圖9 10種浮游植物的代表性PEP + ST脈沖曲線。提供了一些Fv和σPII PEP示例。例子E和J顯示了兩種PEP之間最大的差異，并且可能包括藍藻污染。
基線熒光
不來自于光化學活性PSII復合體的Fo部分被稱為基線熒光，并被量化為Fb。基線熒光在包括JVPII在內的許多熒光參數的計算中引入了誤差。圖10中的數據圖說明了基線校正對STAF衍生的PSII光化學評估與Clark型電極測量的總氧釋放之間匹配的影響。
圖10 氧光曲線（OLC）和熒光光曲線（FLC）同時測量一系列浮游植物物種。在~ 20 °C和30 μmol photons m?2 s?1的培養物上進行測量。FLC數據被標準化為O2的等效單位，OLC和FLC數據歸一化為衍生的功能PSII復合體的濃度（O2 PSII?1s?1）。FLC數據使用KaFO（11800 m?1）或樣品樣本特異性（KaS）值獲得。實線表示P-E曲線擬合。KaS值是通過對所有物種應用內在的Fv/Fm（Fv/Fmc）0.518生成的（公式4）。這些數據原發表于Boatman et al. 2019。
雙ST脈沖測量
雙ST脈沖（DSP）方法結合在這里描述的STAF系統中，跟蹤序列第一個ST脈沖中關閉的PSII復合體的重新開放。ST脈沖通常具有相同的持續時間，它們之間的間隔是可變的（圖11）。
圖11 DSP序列在第一個ST脈沖施加前20 μs開始。在此信號偏移期間以及在第一ST和第二ST脈沖期間，數據以1MHz記錄。在Gap或Sequence間隔期間不記錄任何數據。
默認設置包含11個DSP，在第一個ST脈沖結束和第二個ST脈沖開始之間有400 μs到12800 μs的間隔。RunSTAF設置間隙序列，使得連續對之間的間隙持續時間的增加在整個集合中是恒定的。這個等差數列在下面的例子中很清楚，其中包含6個DSP，間隔在200 μs到6400 μs之間。
圖12 從RunSTAF截圖顯示六個DSP對。目標樣本是暗適應的。所顯示的時間是間隔時間。括號內的數字是第一次和第二次ST脈沖之間可變熒光的回收率%。 RunSTAF對DSP數據集生成三個擬合，如圖13所示。第一個是基于Fv（Fv）的簡單恢復（圖12）。第二和第三個擬合反應中心的重新開放，基于同質連通性（Rho）和PSII復合體的二聚化（Dimer）。這三條擬合的差異在黑暗中的最大，隨光化光E的增大而減少。所有三種擬合包含一個快相和一個慢相。假設快速階段主要是在第一個ST脈沖結束時，QB結合了質體醌或半質體醌的PSII重新開放，而慢相主要是在第一個ST脈沖結束時，RCII重新開放伴隨一個空QB。ΔF和ΔS分別為弛豫相總振幅中屬于快相和慢相的比例。τF和τS分別是快相和慢相的時間常數。
圖13 復合屏幕截圖顯示了來自黑暗和兩個光化水平樣品的弛豫階段的完整DSP數據集。公式5提供了所有三個擬合曲線的基本結構（Fv，Rho，Dimer）。對于Rho和Dimer擬合，F值替代開放階段PSII的比例。
ST的PSII二聚體模型擬合
RunSTAF內的ST數據的二聚體擬合包括以下簡單假設：·每個二聚體中的兩個PSII反應中心是完美連接的（共享相同的光收集系統）。·二聚體間無連接性。
盡管這些假設對ST曲線擬合過程施加了很大的限制，“擬合度”通常非常接近限制性較小的Rho擬合，它允許PSII復合體之間的連接性浮動。如圖14中DSP的示例包括了二聚體擬合。[oo]，[oc]，[cc]分別表示：兩個PSII反應中心都打開，一個打開一個關閉，都關閉。
圖14 暗適應樣品的DSP說明了二聚體的擬合。第一次ST脈沖的結束和第二次脈沖開始的間隔為800 μs。圖中顯示的[oo]，[oc]，[cc]比例為第一次脈沖（黃實線）選擇點的數據。第二個ST脈沖上的[oo]， [oc]和[cc]線的起點假設在兩個ST脈沖間隙的[oc]或[cc]內重開封閉PSII反應中心的概率相等。
ST脈沖誘導σPII2的猝滅
從DSP方法的應用中，一個一致而令人驚訝的觀察結果是σPII的快速瞬態下降，使得第二個ST脈沖值（sσPII）比第一個ST脈沖值低50%（圖15）。這種減少的“恢復”時間低至數百μs，這種恢復的動力學（圖16）與PSII復合體之間的連接性的一致僅限于二聚化。
圖15 從RunSTAF數據屏幕中裁剪在FLC的第一步中σPII （'）， sσPII （'）和Fm（'）的變化。FLC的第一步白色方塊中的數字是入射E（μmol photons m-2s-1）。sσPII （'）中的振蕩跟蹤每個DSP期間的間隙步進。
假設在封閉的PSII絡合物中電荷分離是最好避免的，PSII的二聚化可以被視為光保護。 保護是提供給一個封閉的PSII在一個開放加封閉（oc）二聚體，僅僅是因為一個被吸收的光子在開放的PSII上比在封閉的PSII上更容易導致電荷分離。
ST脈沖后觀察到的σPII降低也可能反映了雙閉合（cc）二聚體內的光保護過程。工作假設是，在DSP測量中觀察到的σPII明顯下降50%，反映了在cc二聚體形成后的最初幾百μs內，需要兩個光化學事件來關閉打開的PSII。反過來，假設這一要求表明在封閉的PSII中存在一個在該時間尺度上起作用的去激勵途徑。雖然這條通道只能在相關的時間范圍內運行一次，但提供了保護（相對于在大多數情況下已經不常見的事件）可能非常有效。
上海奕楓儀器設備有限公司 CopyRight 2009-2019 All Rights Reserved. 滬ICP備07031178號
